Gyvatės nuoduose yra fermentų, kurie hidrolizuoja karboksilo esterio ryšius.Hidrolizės substratai yra fosfolipidai, acetilcholinas ir aromatinis acetatas.Šie fermentai apima tris rūšis: fosfolipazę, acetilcholinesterazę ir aromatinę esterazę.Gyvačių nuoduose esanti arginino esterazė taip pat gali hidrolizuoti sintetinį argininą arba liziną, tačiau gamtoje daugiausia hidrolizuoja baltymų peptidinius ryšius, todėl priklauso proteazei.Čia aptariami fermentai veikia tik esterio substratus ir negali veikti jokios peptidinės jungties.Tarp šių fermentų svarbesnės ir visapusiškai ištirtos biologinės acetilcholinesterazės ir fosfolipazės funkcijos.Kai kurie gyvačių nuodai pasižymi stipriu aromatinės esterazės aktyvumu, kuris gali hidrolizuoti p-nitrofeniletilo esterį, a- arba P-naftaleno acetatą ir indolo etilo esterį.Vis dar nežinoma, ar šį aktyvumą sukelia nepriklausomas fermentas, ar žinomas šalutinis karboksilesterazės poveikis, jau nekalbant apie jo biologinę reikšmę.Kai Agkistrodon halys Japonicus nuodai buvo sureaguoti su p-nitrofeniletilo esteriu ir indolo etilo esteriu, p-nitrofenolio ir indolo fenolio hidrolizatų nerasta;Priešingai, jei šie esteriai reaguos su kobros Zhoushan porūšių gyvačių nuodais ir Bungarus multicinctus gyvatės nuodais, jie greitai hidrolizuojasi.Yra žinoma, kad šie kobros nuodai turi stiprų cholinesterazės aktyvumą, kuris gali būti atsakingas už minėtų substratų hidrolizę.Tiesą sakant, Mclean ir kt.(1971) pranešė, kad daugelis Cobra šeimai priklausančių gyvačių nuodų gali hidrolizuoti indolo etilo esterį, naftaleno etilo esterį ir butilnaftaleno esterį.Šie gyvačių nuodai kilę iš: kobros, juodakakliosios kobros, juodalūpės kobros, auksinės kobros, egiptietiškos kobros, karališkosios kobros, auksinės kobros mambos, juodosios mambos ir baltalūpės mambos (D. aw vis dar žino rytinę rombinę barškutį).
Gyvatės nuodai gali hidrolizuoti metilindolo etilo esterį, kuris yra substratas cholinesterazės aktyvumui serume nustatyti, tačiau šie gyvatės nuodai cholinesterazės aktyvumo nerodo.Tai rodo, kad kobros nuoduose yra nežinomos esterazės, kuri skiriasi nuo cholinesterazės.Norint suprasti šio fermento prigimtį, reikia atlikti tolesnius atskyrimo darbus.
1, fosfolipazė A2
(I) Apžvalga
Fosfolipazė yra fermentas, galintis hidrolizuoti glicerilo fosfatą.Gamtoje yra 5 fosfolipazės rūšys, būtent fosfolipazė A2 ir fosfolipazė
A. , fosfolipazė B, fosfolipazė C ir fosfolipazė D. Gyvačių nuoduose daugiausia yra fosfolipazės A2 (PLA2), keliuose gyvačių nuoduose yra fosfolipazės B, o kitų fosfolipazių daugiausia yra gyvūnų audiniuose ir bakterijose.3-11-4 pav. parodyta šių fosfolipazių veikimo vieta substrato hidrolizei.
Tarp fosfolipazių PLA2 buvo ištirtas daugiau.Tai gali būti labiausiai ištirtas gyvatės nuodų fermentas.Jo substratas yra esterio jungtis antroje Sn-3-glicerofosfato padėtyje.Šis fermentas plačiai randamas gyvačių nuoduose, bičių nuoduose, skorpionų nuoduose ir gyvūnų audiniuose, o PLA2 gausu keturių šeimos gyvačių nuoduose.Kadangi šis fermentas ardo raudonuosius kraujo kūnelius ir sukelia hemolizę, jis taip pat vadinamas „hemolizinu“.Kai kurie žmonės taip pat vadina PLA2 hemolizine lecitinaze.
Ludeeke pirmą kartą nustatė, kad gyvatės nuodai gali gaminti hemolizinį junginį, veikdami lecitiną per fermentus.Vėliau Delezenne ir kt.įrodė, kad kai kobros nuodai veikia arklio serumą arba trynį, jie sudaro hemolizinę medžiagą.Dabar žinoma, kad PLA2 gali tiesiogiai veikti eritrocitų membranos fosfolipidus, suardydamas eritrocitų membranos struktūrą ir sukeldamas tiesioginę hemolizę;Jis taip pat gali veikti serumą arba pridėtą lecitiną, kad susidarytų hemolizinis lecitinas, kuris veikia raudonuosius kraujo kūnelius ir sukelia netiesioginę hemolizę.Nors PLA2 gausu keturiose gyvačių nuodų šeimose, fermentų kiekis įvairiuose gyvačių nuoduose šiek tiek skiriasi.Barškuolė (C
Gyvatės nuodai parodė tik silpną PLA2 aktyvumą.3-11-11 lentelėje parodytas 10 pagrindinių Kinijos nuodingų gyvačių nuodų PLA2 aktyvumo palyginimas.
3-11-11 lentelė 10 gyvačių nuodų fosfolipazės VIII aktyvumo Kinijoje palyginimas
Gyvatės nuodai
Riebalų išsiskyrimas
alifatinė rūgštis,
Cjumolis/mg)
Hemolizinis aktyvumas CHU50/^ g * ml)
Gyvatės nuodai
Išskirkite riebalų rūgštis
(^raolis/mg)
Hemolizinis aktyvumas (HU50/ftg * 1111)
Najanaja atra
9. 62
vienuolika
Mikracefalinė opa
penki taškai vienas nulis
kalyspallas
8. 68
du tūkstančiai aštuoni šimtai
gracilis
V, acutus
7. 56
* * #
Ophiophagus hannah
trys taškai aštuoni du
šimtas keturiasdešimt
Bnugarus fasctatus
7,56
du šimtai aštuoniasdešimt
B. multicinctus
vienas taškas devyni šeši
du šimtai aštuoniasdešimt
Viper ir russelli
septyni taškai nulis trys
T, mucrosquamatus
vienas taškas aštuoni penki
Siamensis
T. stejnegeri
0. 97
(2) Atskyrimas ir valymas
PLA2 kiekis gyvatės nuoduose yra didelis ir yra stabilus karščiui, rūgštims, šarmams ir denatūrantui, todėl jį lengva išvalyti ir atskirti PLA2.Įprastas metodas yra pirmiausia atlikti neapdorotų nuodų filtravimą geliu, tada atlikti jonų mainų chromatografiją ir kitą veiksmą galima pakartoti.Reikėtų pažymėti, kad PLA2 džiovinimas šaldant po jonų mainų chromatografijos neturėtų sukelti agregacijos, nes džiovinimo šaldant procesas dažnai padidina jonų stiprumą sistemoje, o tai yra svarbus veiksnys, sukeliantis PLA2 agregaciją.Be pirmiau minėtų bendrųjų metodų, buvo pritaikyti ir šie metodai: ① Wells ir kt.② PLA2 substrato analogas buvo naudojamas kaip ligandas afininei chromatografijai.Šis ligandas gali prisijungti prie PLA2 gyvatės nuoduose su Ca2+.EDTA dažniausiai naudojamas kaip eliuentas.Pašalinus Ca2+, mažėja afinitetas tarp PLA2 ir ligando ir jis gali būti atskirtas nuo ligando.Kiti naudoja 30% organinį tirpalą arba 6 mol/l karbamidą kaip eliuentą.③ Hidrofobinė chromatografija buvo atlikta naudojant PheiiylSephar0SeCL-4B, kad būtų pašalintas PLA2 pėdsakas iš kardiotoksino.④ Anti PLA2 antikūnas buvo naudojamas kaip ligandas PLA2 afininei chromatografijai atlikti.
Iki šiol buvo išvalyta daugybė gyvačių nuodų PLAZ.Tu ir kt.(1977) išvardijo PLA2, išgrynintą iš gyvačių nuodų iki 1975 m. Pastaraisiais metais kasmet buvo pranešama apie daugybę straipsnių apie PLA2 atskyrimą ir gryninimą.Čia mes sutelkiame dėmesį į Kinijos mokslininkų PLA atskyrimą ir gryninimą.
Chen Yuancong ir kt.(1981) atskyrė tris PLA2 rūšis nuo Agkistrodon halys Pallas nuodų Zhejiang mieste, kurias pagal jų izoelektrinius taškus galima suskirstyti į rūgštinę, neutralią ir šarminę PLA2.Pagal savo toksiškumą neutralus PLA2 yra toksiškesnis, kuris buvo nustatytas kaip presinapsinis neurotoksinas Agkistrodotoksinas.Šarminis PLA2 yra mažiau toksiškas, o rūgštinis PLA2 beveik neturi toksiškumo.Wu Xiangfu ir kt.(1984) palygino trijų PLA2 charakteristikas, įskaitant molekulinę masę, aminorūgščių sudėtį, N-galą, izoelektrinį tašką, terminį stabilumą, fermentų aktyvumą, toksiškumą ir hemolizinį aktyvumą.Rezultatai parodė, kad jie turėjo panašią molekulinę masę ir terminį stabilumą, tačiau turėjo reikšmingų skirtumų kitais aspektais.Fermentų aktyvumo aspektu rūgščių fermentų aktyvumas buvo didesnis nei šarminio;Šarminio fermento hemolizinis poveikis žiurkių raudoniesiems kraujo kūneliams buvo stipriausias, po to seka neutralus fermentas, o rūgštinis fermentas beveik nehemolizuojasi.Todėl spėjama, kad PLAZ hemolizinis poveikis yra susijęs su PLA2 molekulės krūviu.Zhang Jingkang ir kt.(1981) sukūrė Agkistrodotoksino kristalus.Tu Guangliang ir kt.(1983) pranešė, kad toksiškas PLA, kurio izoelektrinis taškas yra 7,6, buvo išskirtas ir išgrynintas iš Vipera rotundus nuodų iš Fudziano ir jo fizinių bei cheminių savybių, aminorūgščių sudėties ir 22 aminorūgščių liekanų sekos N. – buvo nustatytas terminalas.Li Yuesheng ir kt.(1985) išskyrė ir išgrynino kitą PLA2 iš Viper rotundus nuodų Fudziane.PLA2* subvienetas yra 13 800, izoelektrinis taškas yra 10,4, o specifinis aktyvumas yra 35/xnioI/miri mg. Kai substratas yra lecitinas, optimalus fermento pH yra 8,0, o optimali temperatūra yra 65 ° C. LD5, švirkščiamas į veną pelėms.Jis yra 0,5 ± 0,12 mg/kg.Šis fermentas turi akivaizdų antikoaguliantą ir hemolizinį poveikį.Toksiška PLA2 molekulė susideda iš 123 liekanų iš 18 rūšių aminorūgščių.Molekulėje gausu cisteino (14), asparto rūgšties (14) ir glicino (12), tačiau joje yra tik vienas metioninas, o jo N galas yra serino liekana.Palyginti su Tuguang išskirtu PLA2, dviejų izofermentų molekulinė masė ir aminorūgščių liekanų skaičius yra labai panašūs, o aminorūgščių sudėtis taip pat labai panaši, tačiau asparto rūgšties ir prolino liekanų skaičius šiek tiek skiriasi.Guangxi karališkosios kobros gyvatės nuoduose yra daug PLA2.Shu Yuyan ir kt.(1989) iš nuodų išskyrė PLA2, kurio specifinis aktyvumas yra 3,6 karto didesnis už pradinį nuodą, molekulinė masė 13 000, sudėtis iš 122 aminorūgščių liekanų, izoelektrinis taškas 8,9 ir geras terminis stabilumas.Stebint elektroniniu mikroskopu bazinio PLA2 poveikį raudoniesiems kraujo kūneliams, galima pastebėti, kad jis turi akivaizdų poveikį žmogaus raudonųjų kraujo kūnelių membranai, bet neturi akivaizdaus poveikio ožkų raudoniesiems kraujo kūneliams.Šis PLA2 turi akivaizdų lėtinantį poveikį žmonių, ožkų, triušių ir jūrų kiaulyčių raudonųjų kraujo kūnelių elektroforeziniam greičiui.Chen ir kt.Šis fermentas gali slopinti trombocitų agregaciją, kurią sukelia ADP, kolagenas ir natrio arachidono rūgštis.Kai PLA2 koncentracija yra 10/xg/ml~lOOjug/ml, trombocitų agregacija visiškai slopinama.Jei kaip medžiaga buvo naudojami išplauti trombocitai, PLA2 negalėjo slopinti agregacijos, kai koncentracija yra 20 Mg/ml.Aspirinas yra ciklooksigenazės inhibitorius, kuris gali slopinti PLA2 poveikį trombocitams.PLA2 gali slopinti trombocitų agregaciją, hidrolizuodamas arachidono rūgštį, kad susidarytų tromboksanas A2.Agkistrodon halys Pallas nuodų Džedziango provincijoje pagaminto PLA2 tirpalo konformacija buvo tiriama naudojant žiedinį dichroizmą, fluorescenciją ir UV absorbciją.Eksperimentiniai rezultatai parodė, kad šio fermento pagrindinė grandinės konformacija buvo panaši į tos pačios rūšies fermento iš kitų rūšių ir genčių, skeleto konformacija buvo gerai atspari karščiui, o rūgštinės aplinkos struktūriniai pokyčiai buvo grįžtami.Aktyvatoriaus Ca2+ ir fermento derinys neveikia triptofano likučių aplinkos, o inhibitorius Zn2+ veikia priešingai.Būdas, kuriuo tirpalo pH įtakoja fermentų aktyvumą, skiriasi nuo pirmiau minėtų reagentų.
Gyvačių nuodų PLA2 gryninimo procese akivaizdus reiškinys yra tas, kad gyvatės nuoduose yra dvi ar daugiau PLA2 eliuavimo smailių.Šį reiškinį galima paaiškinti taip: ① dėl izofermentų egzistavimo;② Vienos rūšies PLA2 yra polimerizuojamas į įvairius PLA2 mišinius, kurių molekulinė masė yra 9 000–40 000;③ PLA2 ir kitų gyvatės nuodų komponentų derinys apsunkina PLA2;④ Kadangi PLA2 amido jungtis yra hidrolizuojama, krūvis keičiasi.① Ir ② yra dažni, tik su keliomis išimtimis, pvz., PLA2 CrWa/w gyvatės nuoduose
Yra dvi situacijos: ① ir ②.Trečioji sąlyga buvo nustatyta PLA2 šių gyvačių nuoduose: Oxyranus scutellatus, Parademansia microlepidota, Bothrops a ^>er, Palestinos angis, smėlio angis ir siaubingos barškuolės km.
Dėl ④ atvejo PLA2 migracijos greitis elektroforezės metu keičiasi, tačiau aminorūgščių sudėtis nesikeičia.Peptidai gali būti suskaidyti hidrolizės būdu, tačiau paprastai jie vis tiek yra surišti disulfidinėmis jungtimis.Rytinės duobės barškučio nuoduose yra dvi PLA2 formos, atitinkamai vadinamos a ir p tipo PLA2.Skirtumas tarp šių dviejų PLA2 tipų yra tik viena aminorūgštis, tai yra, glutaminas vienoje PLA2 molekulėje yra pakeistas glutamo rūgštimi kitoje PLA2 molekulėje.Nors tiksli šio skirtumo priežastis nėra aiški, paprastai manoma, kad tai susiję su PLA2 deaminacija.Jei palestiniečių angių nuoduose esantis PLA2 bus šiltas kartu su neapdorotais nuodais, jo fermentų molekulių galinių grupių bus daugiau nei anksčiau.Iš C iš gyvatės nuodų išskirtas PLA2 turi du skirtingus N-galus, o jo molekulinė masė yra 30 000. Šį reiškinį gali sukelti asimetrinis PLA2 dimeras, panašus į simetrinį dimerį, kurį PLA2 sudaro rytinės deimantinės barškuolės nuoduose. ir vakarinė deimantinė barškuolė.Azijos kobra susideda iš daugybės porūšių, iš kurių kai kurie nėra labai tiksliai klasifikuojami.Pavyzdžiui, tai, kas anksčiau buvo vadinama Cobra Outer Kaspijos porūšiu, dabar yra atpažįstama
Jis turėtų būti priskirtas išorinei Kaspijos jūros kobrai.Kadangi yra daug porūšių ir jie yra sumaišyti, gyvatės nuodų sudėtis labai skiriasi dėl skirtingų šaltinių, o PLA2 izofermentų kiekis taip pat yra didelis.Pavyzdžiui, kobros nuodai
Mažiausiai 9 rūšių PLA2 izofermentai buvo rasti r ^ ll rūšių, o 7 rūšių PLA2 izofermentai buvo rasti kobros porūšio Kaspijos nuoduose.Durkin ir kt.(1981) ištyrė PLA2 kiekį ir izofermentų skaičių skirtinguose gyvačių nuoduose, įskaitant 18 kobros nuodų, 3 mambos nuodus, 5 angių nuodus, 16 barškulių nuodų ir 3 jūros gyvačių nuodus.Apskritai kobros nuodų PLA2 aktyvumas yra didelis, daug izofermentų.Angių nuodų PLA2 aktyvumas ir izofermentai yra vidutiniai.Mambos nuodų ir barškuoklių nuodų PLA2 aktyvumas yra labai mažas arba visai nėra PLA2 aktyvumo.Jūros gyvatės nuodų PLA2 aktyvumas taip pat mažas.
Pastaraisiais metais nebuvo pranešta, kad gyvatės nuoduose esantis PLA2 egzistuotų aktyvaus dimero pavidalu, pvz., rytinės romboforos barškuolės (C. gyvatės nuoduose yra a ir P tipo PLA2, kuriuos abu sudaro du identiški subvienetai , o turi tik dimerazė
Veikla.Shen ir kt.taip pat pasiūlė, kad tik gyvatės nuodų PLA2 dimeras yra aktyvi fermento forma.Erdvinės struktūros tyrimas taip pat įrodo, kad vakarinės deimantinės barškučio gyvatės PLA2 egzistuoja dimero pavidalu.Žuvis ėdantis junginys
Yra du skirtingi gyvatės nuodų PLA ^ Ei ir E2, kuriuose 仏 egzistuoja dimero pavidalu, dimeras yra aktyvus, o jo disocijuotas monomeras yra neaktyvus.Lu Yinghua ir kt.(1980) toliau tyrė E. Jayanthi ir kt. fizines ir chemines savybes bei reakcijos kinetiką.(1989) iš angių nuodų išskyrė bazinį PLA2 (VRVPL-V).Monomero PLA2 molekulinė masė yra 10 000, kuri turi mirtiną, antikoaguliantą ir edemą.Fermentas gali polimerizuoti skirtingos molekulinės masės polimerus, kai pH 4,8, o polimerizacijos laipsnis ir polimerų molekulinė masė didėja didėjant temperatūrai.96 °C temperatūroje susidariusio polimero molekulinė masė yra 53 100, o šio polimero PLA2 aktyvumas padidėja dviem
Paskelbimo laikas: 2022-11-18